相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡?；罴?xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠(yuǎn)鏡。
功能
相差顯微鏡具有兩個其他顯微鏡所不具有的功能:
①將直射的光(視野中背景光)與經(jīng)物體衍射的光分開;
②將大約一半的波長從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)度的變化。
基本原理
利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?光強(qiáng)度)的差別，經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現(xiàn)觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。
把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ(波長)，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。
幾個問題
(1)相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’n時得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時，這個轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
(2)暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時，該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。
(3)樣品厚度的影響 當(dāng)進(jìn)行相差觀察時，樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄，當(dāng)采用較厚的樣品時，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。
(4)蓋玻片和載玻片的影響 樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求，當(dāng)有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。
特殊構(gòu)造
在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡2個特殊之處：
1.環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。
2.相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：
(1)A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差(或稱負(fù)反差)。
(2)B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差(或稱正反差)，結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。
3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。
4.綠色濾光片：縮小照明光線波長范圍，減少由于照明光線的波長不同引起的相位變化。
